《Bioact. Mater.》：支架孔隙形態調節骨再生機制

骨仿生學和結構工程激發了人們對優化人工支架以實現更好的骨再生的廣泛興趣。然而，支架孔隙形態調節骨再生背后的機制尚不清楚，這使得用于骨修復的支架結構設計具有挑戰性。為了解決這個問題，來自華南理工大學的況宇迪、趙娜如、王迎軍等人仔細評估了三種代表性孔隙形態（即圓柱形（C）、螺旋形（G）和菱形（D））β-TCP支架的成骨性能（圖1a）。結果表明 D 型支架通過增強 RhoA/ROCK2 通路的機械信號轉導促進 BM

SC 向成骨分化并分泌更多與遷移相關的生長因子，從而在這些支架中實現最佳骨再生（圖1b）。這項工作為開發新型生物適應性支架設計提供了對孔隙形態介導的骨再生機制的見解。相關研究成果以“3D printed pore morphology mediates bone marrow stem cell behaviors via RhoA/ROCK2 signaling pathway for accelerating bone regeneration"為題于2023年3月20日發表在《Bioact. Mater.》上。

圖1 不同孔隙形態的支架方案及支架-BMSC相互作用機制：（A）具有圓柱形、螺旋形和菱形孔形態的 3D 打印支架；（B）孔隙形態介導的細胞骨架力和 BMSCs 的核變形通過 RhoA/ROCK2 信號通路促進骨再生

1. 不同孔形態的β-TCP支架上的骨髓間充質干細胞行為

成功制備了三種孔結構的β-TCP支架（圖2a），BMSCs在支架上表現出不同的鋪展狀態(圖2b)。由于細胞的不同伸展和伸長狀態會影響基因的表達，這些支架上的BMSCs可能會表現出不同的細胞行為和命運。隨后制備了一種定制的具有整合路徑的支架（每個路徑由一種孔形態組成）評估BMSCs從支架外到支架內部的遷移行為，如圖2C所示。遷移實驗表明，D-和G-支架具有更好的引導骨再生的潛力（圖2D，E）。CCK8檢測結果顯示，BMSCs在C-支架上的增殖情況明顯好于其他各組(圖2F)，這可能歸因于類多邊形展開態引起的內應力的松弛堿性磷酸酶（ALP）活性（圖2G）和RT-qPCR（圖2H）結果顯示，第7天，D支架組ALP、Col-1、OCN和Runx2的表達最高，C支架組最。低。上述結果證實了D-支架在這些支架中誘導BMSCs成骨分化效。果。最。好。此外，研究了孔形態對BMSCs血管生成因子旁分泌的影響（圖2I）)。成血管測試表明G-支架組BMSC培養上清液中VEGF和Ang-1的濃度最高（圖2J），具有更好的骨再生效果（圖2K,L）。

圖2 骨髓間充質干細胞在不同β-tCP支架上的細胞行為

2. 孔形態介導的骨髓間充質干細胞行為的信號轉導機制

RNA測序結果顯示，與C組相比，D組和G組的一些基因表達上調（圖3A），表明骨髓間充質干細胞在D-支架中的遷移能力最。強。此外，與C-支架組相比，G-和D-支架組中成骨分化相關基因(例如OCN3、BMP2和ALPK1)和血管生成相關因子(例如VEGFA、PDGFC和PDGFA)也上調(圖3B，C)。聚類分析和熱圖的樹狀圖顯示，RhoA/ROCK2信號通路相關基因(DVL2、DAAM1、RhoA和ROCK2)在G-和D-支架組的表達高于C-支架組(圖3D)。RT-qPCR分析和Western blotting也證實了RhoA/ROCK2信號通路相關基因和蛋白在G-支架和D-支架中的高表達(圖3E-L)。這些結果揭示了BMSCs在不同孔形態的支架中進行不同的細胞骨架重組和機械應力傳遞。

圖3 RNA測序和生物信息學分析

隨后，檢測了在不同支架上培養的BMSCs在含有和不含RhoA/ROCK2抑制劑的培養液中的成骨分化和遷移因子水平。當細胞培養液中沒有RhoA/ROCK2抑制劑時，G-和D-支架組比C-支架組RhoA、ROCK2和激活蛋白(p-RhoA、p-ROCK2)水平更高(圖4A-D)。CDC42、OCN和Runx2的蛋白表達水平順序為D-支架>G-支架>C-支架。這些結果表明，RhoA/ROCK2信號通路在轉導支架孔形態刺激調控BMSCs成骨分化和遷移中發揮了重要作用。圖4E是支架孔形態介導的BMSC行為機理圖，孔形態通過RhoA/ROCK2信號通路影響BMSCs成骨分化和遷移。

圖4 (A-C)藥物對RhoA/ROCK2信號通路的干預；(D)用ELISA法檢測在RhoA和RoCK2抑制劑干預前后7天不同孔隙形態的成骨相關Runx2和遷移相關CDC42蛋白的水平；(E)機制綜述：孔形態通過RhoA/ROCK2信號通路影響BMSCs成骨分化和遷移

3. 不同孔形態支架體內骨再生的評價

隨后，構建股骨髁缺損評價支架體內骨再生效果（圖5A）。骨小梁計數、Micro-CT、血管分布檢測、Van Gieson染色(VG)結果均顯示G-和D-支架的血管生成能力強于C-支架，可以促進骨再生。

圖5 股骨髁缺損區術后4周、8周、12周植入支架的組織學分析及Micro-CT檢查

此外，通過連續熒光標記檢測所有支架在2-4周和6-8周的動態成骨來評估骨再生率(圖6)。柱狀缺損區被分為三個部分(外層：0-1 mm，中層：1-2 mm，內層：2-3 mm)，以更好地定量缺損區不同區域的新骨生長(圖6a)。熒光標記染色結果顯示，C-支架組支架的新骨沉積速度從外到中逐漸減慢，C-支架中心區域幾乎沒有新骨(圖6B，C)。相比之下，D和G支架的中層和中心層的骨沉積速率明顯較高，表明細胞在支架中的遷移速率不同。這些結果揭示了支架形態對體內新骨生長的重要指導作用。

圖6 成骨的動態組織學分析

綜上所述，本文在體外和體內評估了三種孔結構的β-TcP支架的成骨潛力。D-支架通過影響BMSCs的黏附狀態，激活較高水平的RhoA/ROCK2信號轉導通路，促進細胞遷移，促進BMSCs的成骨分化。同時，D-支架和G-支架還可通過影響骨髓間充質干細胞的旁分泌來促進血管生成。在體內骨修復的評價中，D-支架在促進骨修復方面的表現優于G-支架和C-支架。這項工作加深了我們對孔形態影響細胞行為的機制的理解。